Μάθημα : Εργαστηριακή δραστηριότητα Βακτηριακού μετασχηματισμού

 1. Εισαγωγή

Η εργαστηριακή διδασκαλία της μοριακής βιολογίας στη δευτεροβάθμια εκπαίδευση περιλαμβάνει την απομόνωση του DNA όπως αυτή παρουσιάζεται στους εργαστηριακoύς οδηγούς του Γυμνασίου (Μαυρικάκη κ.ά., 2010), και του Λυκείου, όπου υποστηρίζεται και από μία δραστηριότητα προσομοίωσης της αντιγραφής και της έκφρασης της γενετικής πληροφορίας (Αλεπώρου-Μαρίνου Β. κ.ά., 2010). Στην παρούσα εργασία παρουσιάζουμε μια ακόμη εργαστηριακή δραστηριότητα που θα επιτρέψει όχι μόνο την πληρέστερη κάλυψη των εφαρμογών της βιοτεχνολογίας, αλλά θα μπορούσε ανάλογα με την διδακτική προσέγγιση που θα επιλεχθεί να προσφέρει μια ανασκόπηση σε αρκετές από τις έννοιες της βιολογίας. Η εργαστηριακή δραστηριότητα του βακτηριακού μετασχηματισμού, είναι μια δραστηριότητα μοριακής βιολογίας, γενετικής μηχανικής και βιοτεχνολογίας κατάλληλα διαμορφωμένη ώστε να μπορούν να την διαχειριστούν ακόμη και μαθητές του Γυμνασίου (Συγγραφείς, Εργασία 1).

Η μεθοδολογία του βακτηριακού μετασχηματισμού βασίζεται στην αξιοποίηση των πλασμιδίων, τα οποία είναι σχετικά μικρά δίκλωνα κυκλικά μόρια DNA και υπάρχουν σε ορισμένα βακτήρια (επιπλέον εξωχρωμοσωματικό γενετικό υλικό). Τα πλασμίδια έχουν τη δυνατότητα να μεταφέρονται από ένα βακτήριο σε άλλο μέσω της βακτηριακής σύζευξης, να λειτουργούν δηλαδή ως φορείς του γενετικού υλικού που διαδίδουν οριζόντια νέα γονίδια και προσδίδουν νέα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά. Στην σύγχρονη Mοριακή Βιολογία η αξία τους συνίσταται στην δυνατότητα του ερευνητή να τα τροποποιεί in vitro με τεχνικές ανασυνδυασμένου DNA και να τα εισάγει σε ζωντανά κύτταρα με τεχνικές μεθόδους (Βούλγαρη Ε., 2012). Στη συγκεκριμένη εφαρμογή θα αξιοποιηθούν δύο πλασμίδια στα οποία έχει ενσωματωθεί η γενετική πληροφορία για τη σύνθεση δύο πρωτεϊνών που έχουν πράσινο και κόκκινο χρώμα αντίστοιχα και φθορίζουν και ταυτόχρονα προσδίδουν ανθεκτικότητα σε διαφορετικά αντιβιοτικά στα βακτήρια φορείς.

Η πρόταση μας είναι μια απόπειρα απλοποίησης αντίστοιχων δραστηριοτήτων (BIOTECH Project, 2013) που φαίνεται να υλοποιούνται με επιτυχία σε ένα περιβάλλον υψηλής τεχνολογικής υποστήριξης.

2. Μεθοδολογία

Υλικά: Τα υλικά για τη δραστηριότητα του βακτηριακού μετασχηματισμού από πέντε ομάδες περιέχονται σε μία συσκευασία (κιτ) που περιλαμβάνει για κάθε ομάδα: (1) Ένα πλαστικό ραβδάκι σχήματος Τ, (2) τέσσερα τρυβλία Petri με στερεό θρεπτικό υλικό LB από τα οποία το πρώτο χωρίς κανένα αντιβιοτικό, και τα επόμενα τρία με αμπικιλλίνη, καναμυκίνη και σπεκτινομυκίνη αντίστοιχα. (3) ένα σωλήνα eppendorf με υγρό θρεπτικό υλικό LB, (4) δύο αποστειρωμένες πλαστικές πιπέτες Pasteur (5) ένα σωλήνα eppendorf με βακτήρια E.coli ικανά για μετασχηματισμό και (6) ένα σωλήνα eppendorf με μία από τις δύο παραλλαγές του πλασμιδικού DNA. Το πρώτο πλασμίδιο περιέχει γονίδια που κωδικοποιούν την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) και την ανθεκτικότητα στην καναμυκίνη και το δεύτερο περιέχει γονίδια που κωδικοποιούν την κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (RFP) και την ανθεκτικότητα στην σπεκτινομυκίνη. Ο εκπαιδευτής -αλλά όχι οι εκπαιδευόμενοι- γνωρίζει ποιοι σωλήνες-δείγματα περιέχουν το ένα ή το άλλο πλασμίδιο. Η πρόκληση στους εκπαιδευόμενους είναι να αναγνωρίσουν ποιές ιδιότητες επάγει το μυστηριώδες DNA που παρέλαβαν.

Για την υλοποίηση αυτής της δραστηριότητας μπορεί να αξιοποιηθεί η υποδομή ενός συνηθισμένου Σχολικού Εργαστηρίου Φυσικών Επιστημών που αναμένεται να προσφέρει πάγκους εργασίας, 6 λύχνους Bunsen ή απλά γκαζάκια ανοικτής φλόγας, ψυγείο και υδατόλουτρο με θερμοστάτη.

Μέθοδος: Η δραστηριότητα οπώς αναπαρίσταται στην Εικ.1, εξελίσσεται σε δύο συναντήσεις που υποστηρίζονται από αντίστοιχα φύλα εργασίας. Η πρώτη διάρκειας 30-45 λεπτών περιλαμβάνει το μετασχηματισμό των βακτηριών και την καλλιέργεια τους.

Μετά την εισαγωγή στο θέμα του εργαστηρίου, οι εκπαιδευόμενοι μεταφέρουν τα βακτήρια στο σωλήνα με το μυστηριώδες DNA με απλή μετάγγιση κοντά σε ανοικτή φλόγα για να αποφευχθούν τυχόν μολύνσεις. Στη συνέχεια για να εισάγουν το πλασμιδικό DNA στα βακτήρια μεταφέρουν το δείγμα βακτήρια + DNA κατευθείαν στο υδατόλουτρο στους 42^oC για 90 δευτερόλεπτα ακριβώς και στη συνέχεια προσθέτουν με απλή μετάγγιση, κάτω από στείρες συνθήκες, το υγρό θρεπτικό υλικό LB στο σωλήνα με τα μετασχηματισμένα πλέον βακτήρια. Ακολούθως, κάτω από στείρες συνθήκες, μοιράζουν με απλή μετάγγιση το διάλυμα των βακτηρίων στα τέσσερα τρυβλία Petri και το απλώνουν ομοιόμορφα με το ραβδάκι σχήματος Τ. Μετά τυλίγουν τις καλλιέργειες με μεμβράνη κουζίνας και τα επωάζουν σε θερμοκρασία δωματίου για δύο ημέρες για να πολλαπλασιαστούν τα βακτήρια και να αναπτυχθούν οι αποικίες τους. Εναλλακτικά οι αποικίες μπορεί να είναι εμφανείς ακόμη και μετά από 24 ώρες επώασης στους 37^οC. Μετά από αυτό τα γενετικά τροποποιημένα βακτήρια μπορούν να διατηρηθούν στο ψυγείο για μερικές εβδομάδες.

Την επόμενη ημέρα (η αν είναι δυνατόν μετά από δύο ημέρες) οι εκπαιδευόμενοι παραλαμβάνουν τα τρυβλία με τις καλλιέργειες των βακτηρίων, αναγνωρίζουν την παρουσία μετασχηματισμένων βακτηρίων και καταγράφουν το φαινότυπό τους.

Εικόνα 1.  Σχηματική αναπαράσταση της  διαδικασίας του βακτηριακού μετασχηματισμού

3. Αποτελέσματα

Κατά τη δεύτερη συνάντηση διάρκειας 30-40 λεπτών οι εκπαιδευόμενοι προβλέπουν το φαινότυπο των καλλιεργειών ανάλογα με το είδος του DNA που εισάγεται στα βακτήρια και μετά παραλαμβάνουν τις καλλιέργειες των βακτηρίων που τροποποίησαν γενετικά στη προηγούμενη συνάντηση. Αναμένεται η εμφάνιση αποικιών όπως στην εικόνα 2, όπου στο τρυβλίο Petri που περιέχει θρεπτικό υλικό LB και αντιβιοτικό σπεκτινομυκίνη έχουν αναπτυχτεί αποικίες βακτηρίων με κόκκινο χρώμα. Στη συνέχεια οι εκπαιδευόμενοι φωτογραφίζουν τα τρυβλία και τα χαρακτηρίζουν συμπληρώνοντας τον πίνακα 1.

Εικόνα 2. Φωτογραφία αποικιών γενετικά τροποποιημένων βακτηρίων, που αναπτύσσονται σε τρυβλίο με το αντιβιοτικό σπεκτινομυκίνη και συνθέτουν ερυθρή πρωτεΐνη που φθορίζει ((RFP)

Πίνακας 1: Παρατήρηση και καταγραφή των φαινοτύπων των βακτηρίων μετά τον μετασχηματισμό

Χρησιμοποιώντας σα παράδειγμα την εικόνα 2, θα μπορούσαμε να καταγράψουμε τις παρατηρήσεις μας στο πίνακα 1, στη στήλη “LB άγαρ + σπεκτινομυκίνη” και να σημειώσουμε: δεκάδες αποικίες ερυθρού χρώματος.

4. Συμπεράσματα

Μετά την ολοκλήρωση των παρατηρήσεων οι εκπαιδευόμενοι προσδιορίζουν τα χαρακτηριστικά που επάγει το μυστηριώδες DNA που χρησιμοποίησαν. Στο χρόνο που απομένει οι εκπαιδευόμενοι αρθρώνουν τα συμπεράσματα τους και τα παρουσιάζουν σε μορφή πόστερ που αποτελεί και το τελικό παραδοτέο της δραστηριότητας. Μπορούν να επιλέξουν αν θα αναφερθούν ανάλογα με τα ενδιαφέροντα τους στο πλαίσιο της βιοτεχνολογίας ή του κεντρικού δόγματος της βιολογίας. Στη φάση αυτή θα διερευνηθεί η δυνατότητα απομόνωσης των φθοριζουσών πρωτεϊνών για τη πληρέστερη προσέγγιση τόσο του κεντρικού δόγματος της βιολογίας όσο και της αξιοποίησης της βιοτεχνολογίας Ακόμη σε αυτό το σημείο μπορεί να αναζητηθεί η πρόταση παραλλαγών και επεκτάσεων, καθώς και η αξιολόγηση της δραστηριότητας.

5. Βιβλιογραφία

Αλεπώρου-Μαρίνου Β. Αργυροκαστρίτης Α. Κομητοπούλου Α. Πιαλόγλου Π. 2010 Εργαστηριακός Οδηγός Βιολογία θετικής κατεύθυνσης Γ' τάξης Γενικού Λυκείου, Έκδοση Ι, Οργανισμός εκδόσεως διδακτικών βιβλίων Αθήνα 2010

Βούλγαρη Ε. (2012) Εργαστηριακές δραστηριότητες βιολογίας. http://mde-didaktiki.biol.uoa.gr/mde9/boulgari/labcornerintroduction.html προσπέλαση Φεβρουάριος 2015

Διδακτικές προσεγγίσεις και πειραματική διδασκαλία στις Φυσικές Επιστήμες. http://physcool.web.auth.gr/synedrio2016/ προσπέλαση Δεκέμβριος 2015

Μαυρικάκη Ε. Γκρούβα Μ. Καμπούρη Α. (2010) Βιολογία Γ' Γυμνασίου Εργαστηριακός οδηγός. ISBN 960-06-2027-x

BIOTECH Project (2013) Department of Molecular and Cellular Biology The University of Arizona http://biotech.bio5.org/activities προσπέλαση Δεκέμβριος 2015